猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

陆川猪ANKRD1基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪心肌锚蛋白重复域1基因(ANKRD1),并进行生物信息学及组织表达谱分析,为研究ANKRD1在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据.[方法]根据NCBI已公布的野猪ANKRD1基因序列(NM_213922.1)设计特异性引物,采用TRIzol法提取陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪的总RNA,反转录合成cDNA,并以此为模板进行ANKRD1基因克隆,通过MegAlign、Protaram、Protscale、MHMM Server和Sig-nalP等在线分析软件进行生物信息学分析,最后以实时荧光定量PCR检测ANKRD1基因在陆川猪各组织中的表达情况.[结果]陆川猪ANKRD1基因蛋白编码区(CDS)序列全长960 bp,编码319个氨基酸残基,与NCBI已公布野猪ANKRD1基因(NM_213922.1)的CDS序列存在4处碱基突变,但均为同义突变,二者的ANKRD1氨基酸序列同源性为99.6%.陆川猪ANKRD1基因编码蛋白分子量为36125.70 Da,理论等电点(pI)为7.09,属于稳定蛋白,其二级结构中α-螺旋占46.39%、无规则卷曲占39.81%、β-转角占9.09%、延伸链占4.70%;陆川猪ANKRD1蛋白不存在跨膜结构,也无信号肽,有多个磷酸化位点.陆川猪ANKRD1基因在其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等7个组织中均有表达,其中以心脏中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同),在脾脏中的相对表达量最低,显著低于在心脏、肝脏、肺脏和背最长肌中的相对表达量.[结论]ANKRD1基因在陆川猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等组织中均有表达,且存在明显差异,故推测ANKRD1基因在不同组织中发挥不同作用.     

对猪小腔卵泡孤雌激活胚胎发育力的初步探索

为探讨直径为2 mm以下和2～6 mm猪卵泡卵母细胞的体外培养分裂率与囊胚率差异,采用相同体外成熟培养条件,来培养从不同直径的2种卵泡中所抽出的卵母细胞,在卵母细胞成熟培养后44～48 h,对卵母细胞进行化学激活和体外培养,观察胚胎体外发育能力;在培养48 h时进行分裂数据统计,培养168 h时统计囊胚个数。结果发现,2 mm以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率差异显著,分别为62.46%、81.76%(P0.05);2 mm以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率差异不显著,分别为11.71%、15.30%。说明正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞在体外成熟后,孤雌激活胚分裂率依次降低,孤雌胚胎的分裂能力随卵泡直径的增大而增强;正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞体外成熟后,孤雌激活胚囊胚率随卵泡直径的增大有一定增高,但变化不显著。     

猪场几点精细管理技术点滴

<正>随着规模化猪场不断发展壮大,养猪企业不断增多,猪场管理问题也逐渐成为影响养猪企业经济效益的关键因素。特别是在市场低迷、利润空间小的情况下,做好猪场管理精细化,才能保证企业经济效益。笔者通过对规模化猪场管理工作进行实地调研,分析猪场管理具体工作要点,总结出以下几点精细管理技术,供养猪同仁参考。     

卵黄抗体五种提取工艺比较及初步应用

为了得到较优的卵黄抗体提取工艺,试验改良了辛酸法、水稀释法、氯仿法、硫酸铵沉淀法与聚乙二醇沉淀法5种提取方法。IPGT诱导表达重组猪致病性大肠杆菌(Escherichia coli)毒素STxB蛋白(rSTxB),与佐剂71VG乳化制备免疫原免疫蛋鸡,利用改良的聚乙二醇沉淀法提取高免卵黄抗体,采用SDS-PAGE电泳检测抗体纯度,通过Western blot检测卵黄抗体和血清抗体效价。结果表明,辛酸法、水稀释法、氯仿法、硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法提取效率分别为96.00、81.99、155.50、65.34、46.00 mg/mL,其中聚乙二醇沉淀法的提取纯度最高。重组STxB蛋白分子量大小约25 kDa,血清中抗体效价最高达到64 000倍,卵黄抗体最高稀释倍数为16 000倍。综合评估,聚乙二醇的提取法相对较优,且提取的卵黄抗体具有良好的免疫活性。     

不同月龄广西富凤麻公鸡的繁殖性能比较

[目的]明确不同月龄广西富凤麻公鸡间的繁殖性能差异和相关性,为其种质资源保护提供更好的配种条件,同时为种鸡生产提供参考依据.[方法]以广西富凤麻公鸡为研究对象,从精液品质、睾丸发育状况及血清激素等角度系统研究不同月龄公鸡间的繁殖性能差异和相关性,并使用不同月龄公鸡的精液对母鸡进行人工授精,孵化第9 d照蛋并统计受精率.[结果]5、8和18月龄广西富凤麻公鸡的精液体积和精子密度无显著差异(P>0.05,下同),18月龄广西富凤麻公鸡的精子活力较5和8月龄公鸡的精子活力极显著降低(P<0.01,下同),在精子畸形率方面则表现为18月龄广西富凤麻公鸡较5和8月龄公鸡极显著升高.广西富凤麻公鸡在5~8月龄期间,随着月龄的增长公鸡睾丸的体积和重量均呈上升趋势,睾丸曲细精管直径呈增粗趋势,血清睾酮含量呈上升趋势;但在8~18月龄期间,整体上表现为随着月龄的增长公鸡睾丸的体积和重量呈下降趋势,睾丸曲细精管直径逐渐变细,且血清睾酮含量急剧下降.广西富凤麻公鸡各繁殖性能指标间的相关性分析发现,血清睾酮含量与两侧睾丸总重量、精液体积与精子活力呈中等强度正相关,精子畸形率与血清睾酮含量、精子活力与精子畸形率呈强负相关.不同月龄广西富凤麻公鸡精液的受精率无显著差异.[结论]广西富凤麻公鸡在5~8月龄期间其繁殖性能随着月龄的增长而提高,但在8~18月龄期间整体上表现为繁殖性能随月龄的增长而下降.即8月龄广西富凤麻公鸡睾丸发育状况最佳,生产上可适当提高8月龄公鸡的利用率.     

杂交构树叶多酚提取工艺优化及其抗氧化活性研究

为建立和优化杂交构树叶多酚的提取工艺,本试验采用超声波辅助提取的方法,以构树叶多酚得率为考察指标,通过单因素试验研究液料比、乙醇浓度、超声时间、超声温度4个因素对构树叶多酚得率的影响;在单因素试验的基础上,借助响应面法设计4因素3水平的试验方案,对构树叶多酚提取的工艺参数进行优化,建立回归模型并进行响应面分析,最终确定最佳的提取工艺参数,并进行3次平行验证;以维生素C为对照,通过测定构树叶多酚对DPPH和ABTS自由基的清除率,评价构树叶多酚的体外抗氧化活性。结果显示：4个因素对构树叶多酚得率的影响顺序依次为：乙醇浓度（B） > 液料比（A） > 超声温度（D） > 超声时间（C）,响应面分析结果显示：两两因素之间存在交互作用,但交互作用不显著（P>0.05）;在液料比为70：1、乙醇浓度为60%、超声时间为50 min、超声温度50 ℃的条件下,构树叶多酚的得率最大,为13.62 mg/g,与响应面法的预测值接近;体外抗氧化试验结果表明,构树叶多酚可以清除DPPH和ABTS自由基,并且在高浓度情况下可以达到与维生素C相当的水平。综上,试验建立的构树叶多酚提取工艺准确、可行,同时证明构树叶多酚具有良好的抗氧化活性;该结果可为构树叶多酚的生物活性研究以及构树叶的药用价值开发提供参考。     

用免疫抑制素提高水牛超排效果的初步研究

为了探讨免疫抑制素对水牛超排的作用,进一步揭示水牛超排机理,选取17头具有正常发情周期的母水牛,随机分为试验组(10头),对照组(7头),试验组首次免疫重组猪抑制素亚基融合蛋白1 mg/头,首免后第28和第56天分别进行加强免疫,剂量为0.5 mg/头,对照组牛同期注射矿物油与生理盐水混合佐剂。试验组牛在首免、二免和三免当天分别用B超仪进行卵泡大小监测和计数,在超排后第6天用B超仪进行卵泡和黄体数进行统计。用免疫抑制素组水牛平均卵泡数在加强免疫后,卵泡数量从8.8增加到15.0个,但与对照组相比差异不显著(P>0.05)。超排后,试验组的平均成熟卵泡数、黄体数和排卵率分别是12.2±0.79,9.0±1.06和73.77%,与对照组相比差异显著。胚胎回收总数和可用胚胎数差异不显著。结果表明,利用免疫抑制素免疫水牛,可提高水牛的超排效果。     

西番莲多糖提取物对猪圆环病毒2型感染RAW264.7细胞氧化应激的影响

为研究西番莲多糖提取物（Passiflora edulis polysaccharide extract，PEPE）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）感染RAW264.7细胞氧化应激相关因子的影响，本试验探讨了PEPE对氧化应激的调节作用。在96孔细胞培养板中每孔加入100 μL浓度为1×10⁶个/mL的RAW264.7细胞，分别设细胞对照组、PEPE组（25、50、100、200、400、800和1 600 μg/mL），分别于培养箱培养24和48 h，用MTT法检测细胞活性，筛选PEPE的药物安全浓度范围。试验分为以下6个组：细胞对照组、病毒组、PEPE高（400 μg/mL）、中（200 μg/mL）、低（100 μg/mL）剂量组及维生素C组，其中细胞对照组加入含10% FBS的DMEM培养液，其余组加入PCV2病毒液，孵育2 h后在PEPE组加入对应浓度的PEPE溶液，VC组加入配制好的VC溶液，细胞对照组和病毒组加入含10% FBS的DMEM培养液，培养48 h，同样用MTT法检测细胞活性，以研究PEPE对PCV2感染RAW264.7细胞活性的影响。按照上述6个试验组分组，处理同上，将细胞培养12 h，收集样品用于检测氧化应激相关因子水平。用Griess法和DCFH-DA荧光探针分别检测RAW264.7细胞上清中NO含量和细胞内活性氧（ROS）水平、OPT荧光法检测细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量，化学发光法检测细胞内黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力。结果显示，PEPE对RAW264.7细胞的安全浓度范围为25~400 μg/mL。PCV2感染RAW264.7细胞后，细胞活性显著降低（P<0.05），而不同浓度PEPE处理组均能提高细胞活性。RAW264.7细胞被PCV2感染后，细胞分泌NO、ROS水平，GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性显著升高（P<0.05），感染细胞GSH含量显著降低（P<0.05）；PEPE作用于PCV2感染的RAW264.7细胞，显著降低感染细胞NO、ROS水平、GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性（P<0.05），100 μg/mL PEPE处理组细胞GSH水平显著升高（P<0.05）。本试验结果表明，PEPE能提高PCV2感染RAW264.7细胞的抗氧化能力，有利于缓解病毒感染所致氧化应激。     

努比亚山羊LMCD1基因生物信息学分析、真核表达载体的构建及表达

【目的】 扩增努比亚山羊LIM结构域基因1（LIM domain gene 1,LMCD1）并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测LMCD1基因的表达情况,为研究努比亚山羊LMCD1基因功能及探究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的作用提供依据。【方法】 从努比亚山羊背最长肌组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增LMCD1基因CDS区序列,并进行生物信息学分析;将LMCD1基因以同源重组的方式连接pEGFP-N1载体,经酶切、测序鉴定后重组阳性质粒命名为pEGFP-N1-LMCD1;将pEGFP-N1-LMCD1重组质粒转染至山羊骨骼肌卫星细胞,通过实时荧光定量PCR检测努比亚山羊LMCD1基因的表达情况。【结果】 努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列全长1 092 bp,编码363个氨基酸。LMCD1蛋白分子式为C₁₇₇₅H₂₈₁₈N₅₀₈O₅₃₃S₂₉,分子质量为40.73 ku。努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列与山羊相似性最高（99.8%）,与斑马鱼相似性最低（55.4%）,与其他物种的相似性在87.0%~98.8%之间。LMCD1蛋白无信号肽,不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。通过构建努比亚山羊pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体并转染至骨骼肌卫星细胞,过表达LMCD1基因,产生绿色荧光信号。【结论】 试验成功扩增LMCD1基因CDS区序列,构建了pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体,并分析了生物学功能,为后续开展LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的机制研究提供了理论基础。